近日，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院陳業(yè)團(tuán)隊(duì)于國(guó)際期刊Metabolic Engineering發(fā)表研究論文"Versatile xylose and arabinose genetic switches development for yeasts"。該研究利用來(lái)自曲霉菌種的轉(zhuǎn)錄激活因子X(jué)lnR和AraRA以及細(xì)菌轉(zhuǎn)錄阻遏因子X(jué)ylR和AraRR，在酵母中開(kāi)發(fā)了基于廉價(jià)誘導(dǎo)劑的高誘導(dǎo)強(qiáng)度，低泄漏的木糖和阿拉伯糖誘導(dǎo)系統(tǒng)。
釀酒酵母作為重要的真核模式生物和細(xì)胞工廠，已經(jīng)有大量的天然或人工誘導(dǎo)系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)。但是，用于實(shí)際生產(chǎn)的大規(guī)模發(fā)酵的誘導(dǎo)系統(tǒng)依然局限于內(nèi)源的半乳糖(GAL)系統(tǒng)。然而，半乳糖誘導(dǎo)系統(tǒng)存在若干不足，主要表現(xiàn)在對(duì)葡萄糖的抑制作用導(dǎo)致生長(zhǎng)與生產(chǎn)過(guò)程難以分離，以及復(fù)雜的內(nèi)源調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在不同營(yíng)養(yǎng)條件下導(dǎo)致誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)行為的復(fù)雜性。此外，基因表達(dá)的誘導(dǎo)依賴于易降解且成本較高的半乳糖。D-木糖和L-阿拉伯糖作為農(nóng)業(yè)廢棄物（如秸稈）水解產(chǎn)物的主要組分，具有成本低廉的優(yōu)勢(shì)。鑒于釀酒酵母無(wú)法天然降解這些糖類，它們成為理想的專一性誘導(dǎo)劑，可用于生產(chǎn)大量化學(xué)品或蛋白質(zhì)。
自2015年以來(lái)，科學(xué)家已經(jīng)在酵母中開(kāi)發(fā)了一些木糖基因表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)。過(guò)往的木糖誘導(dǎo)系統(tǒng)大多基于原核生物的阻遏轉(zhuǎn)錄因子X(jué)ylRR構(gòu)建，但是這些系統(tǒng)都有一個(gè)普便存在的問(wèn)題：最大誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平偏低，且轉(zhuǎn)錄因子的濃度需要細(xì)調(diào)以避免引發(fā)宿主生長(zhǎng)毒性。內(nèi)在調(diào)控原理-阻遏轉(zhuǎn)錄因子的去阻遏以及原核生物與真核生物的轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制的截然不同，決定了很難改造已有的木糖轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)系統(tǒng)。
文章上線截圖
絲狀真菌是生態(tài)環(huán)境中的分解者，具有強(qiáng)大的分解代謝能力，因此研究團(tuán)隊(duì)著重在這類菌種中篩選能響應(yīng)木糖及阿拉伯糖的轉(zhuǎn)錄激活因子。通過(guò)構(gòu)建基于熒光報(bào)告基因的篩選系統(tǒng)，團(tuán)隊(duì)最終找到了來(lái)自構(gòu)巢曲霉和黑曲霉的轉(zhuǎn)錄激活因子-XlnR (AN7610)和AraRA (An04g08600)，能在釀酒酵母中分別劑量響應(yīng)木糖及阿拉伯糖并啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
為克服天然啟動(dòng)子的局限性，如序列冗長(zhǎng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號(hào)多樣及結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，研究團(tuán)隊(duì)采用結(jié)構(gòu)緊湊的釀酒酵母ADH2強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子作為基礎(chǔ)，將XlnR的結(jié)合一致性序列xlno替換ADR1的結(jié)合序列，成功開(kāi)發(fā)出響應(yīng)木糖的半合成啟動(dòng)子，顯著增強(qiáng)了木糖誘導(dǎo)下的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。通過(guò)構(gòu)建TSS與TATA-box、TATA-box與poly(A)區(qū)域間隔序列的文庫(kù)，并調(diào)整轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序（motif）的數(shù)量，成功開(kāi)發(fā)出具有廣泛動(dòng)態(tài)范圍的全合成誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
基于轉(zhuǎn)錄激活因子的誘導(dǎo)系統(tǒng)通常泄漏水平較高，為應(yīng)對(duì)泄漏水平較高的問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)引入了原核生物的轉(zhuǎn)錄阻遏抑制信號(hào)，并設(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)錄激活/抑制的雙調(diào)控系統(tǒng)。這一創(chuàng)新使得木糖雙調(diào)控系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍擴(kuò)展至4000倍以上，且最大誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性達(dá)到釀酒酵母強(qiáng)組成型啟動(dòng)子TDH3活性的兩倍以上。同樣阿拉伯糖雙調(diào)控誘導(dǎo)系統(tǒng)動(dòng)態(tài)范圍達(dá)300倍，最大誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性與TDH3啟動(dòng)子活性相當(dāng)。重要的是，農(nóng)業(yè)廢棄物如玉米芯未經(jīng)處理的水解物也可以充分激活該木糖誘導(dǎo)系統(tǒng)。最后，研究團(tuán)隊(duì)綜合比較了本研究開(kāi)發(fā)的木糖及阿拉伯糖誘導(dǎo)系統(tǒng)與釀酒酵母中常用的誘導(dǎo)系統(tǒng)（天然系統(tǒng)如GAL系統(tǒng),Cu2+誘導(dǎo)啟動(dòng)子PCUP1,甲硫氨酸抑制啟動(dòng)子PMET3以及基于雌激素受體ER的合成誘導(dǎo)系統(tǒng)LexA-ER-VP16/B112），證實(shí)木糖雙調(diào)控系統(tǒng)就調(diào)控嚴(yán)謹(jǐn)性，誘導(dǎo)激活水平、動(dòng)態(tài)范圍、誘導(dǎo)速度和對(duì)宿主的生長(zhǎng)影響方面優(yōu)于現(xiàn)有系統(tǒng)。
研究團(tuán)隊(duì)驗(yàn)證了這兩套誘導(dǎo)系統(tǒng)在高滴度（>100 mg/L）芳樟醇生產(chǎn)中的實(shí)用性，同時(shí)證實(shí)了使用玉米芯水解物作為唯一碳源和誘導(dǎo)劑來(lái)源，也能實(shí)現(xiàn)高滴度芳樟醇的生產(chǎn)。最后，團(tuán)隊(duì)也證明了基于XlnR的木糖誘導(dǎo)系統(tǒng)可遷移到工業(yè)菌株如畢赤酵母、病原菌如光滑念珠菌和白色念珠菌（CUG支系酵母）。在畢赤酵母中，基于XlnR的木糖誘導(dǎo)系統(tǒng)的最大誘導(dǎo)水平高于其經(jīng)典的甲醇誘導(dǎo)系統(tǒng)，并證實(shí)了其用于生產(chǎn)分泌蛋白的實(shí)用性。
本研究不僅為酵母提供了強(qiáng)大的遺傳開(kāi)關(guān)，還提出了一種將激活/抑制信號(hào)整合到合成啟動(dòng)子中的通用策略，以實(shí)現(xiàn)最優(yōu)性能。
木糖及阿拉伯糖誘導(dǎo)系統(tǒng)開(kāi)發(fā)策略，設(shè)計(jì)原理及應(yīng)用
本文第一作者是中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院助理研究員郭淑慧，通訊作者是中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院研究員陳業(yè)。該工作獲得了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金，以及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院的支持。
團(tuán)隊(duì)相關(guān)亮點(diǎn)成果
通過(guò)與該研究相似的轉(zhuǎn)錄因子重構(gòu)結(jié)合合成啟動(dòng)子方法，以及對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域及啟動(dòng)子模塊的精準(zhǔn)設(shè)計(jì)，可以在釀酒酵母及大腸桿菌中對(duì)于任意轉(zhuǎn)錄信號(hào)進(jìn)行優(yōu)化?；谠摲椒?，陳業(yè)團(tuán)隊(duì)與湖南大學(xué)的合作成果，以"On-Chip Engineered Living Materials as Field-Deployable Biosensing Laboratories for Multiplexed Detection"為題，已在Advanced Functional Materials期刊上發(fā)表，中國(guó)科學(xué)院大學(xué)碩士黎欣睿完成了細(xì)胞傳感器的開(kāi)發(fā)。
原文鏈接
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202416830
基于微流控芯片的現(xiàn)場(chǎng)可部署的ELM生物傳感實(shí)驗(yàn)室（ELMlab-on-Chip）設(shè)計(jì)原理
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